差示掃描熒光法(Differential Scanning Fluorimetry，簡稱DSF)是一種先進的蛋白質穩定性分析技術，近年來在生物科學研究和藥物研發領域得到了廣泛應用。本文將詳細介紹DSF的基本原理、實驗過程、優勢以及其在蛋白質穩定性分析中的應用，幫助讀者快速了解這一技術。
一、DSF的基本原理
DSF通過監測蛋白質在升溫過程中的熒光信號變化，來評估蛋白質的熱穩定性。其基本原理可以分為染料法DSF和無標記DSF(Nano DSF)兩種。
染料法DSF：染料法DSF常用的是SYPRO Orange染料。SYPRO Orange是一種環境敏感的疏水染料，當溫度升高時，蛋白質發生去折疊，疏水部分暴露出來，染料與蛋白質的疏水部分特異性結合，導致熒光增強。通過監測熒光強度的變化，可以計算出蛋白質的熔解溫度(Tm值)，即折疊蛋白與去折疊蛋白相等時的溫度。Tm值越高，表明蛋白質的熱穩定性越強。
無標記DSF(Nano DSF)：無標記DSF則是基于蛋白質去折疊過程中色氨酸發射光譜的位移進行檢測。通過檢測熒光變化，可以在非標記環境下評估蛋白質的熱穩定性、化學穩定性、膠體穩定性、等溫穩定性及變復性能力等性質。
二、DSF的實驗過程
DSF實驗主要包括儀器準備、樣品準備、反應體系配置、上機檢測和數據分析幾個步驟。
儀器準備：DSF實驗主要利用熒光定量PCR儀，在96孔或384孔PCR板上完成平行檢測，以實現高通量篩選目的蛋白和化合物。
樣品準備：蛋白樣品需要具有較高的純度(約75%)，化合物的純度通過LC-MS質檢。SYPRO Orange是目前DSF實驗中應用廣泛的染料，此外，還有一些特殊的染料用于特定蛋白的研究，如1,8-ANS、2,6-ANS、2,6-TNS、oxazole系列和BODIPY、BFC系列染料探針。
反應體系配置：根據實驗設計，將蛋白和配體配置成不同濃度的體系，置于96孔板或384孔板中。反應體系主要包括蛋白樣品、反應緩沖液、熒光染料及候選的化合物配體，每檢測孔樣品體積為20~25?L，以蛋白緩沖液作為空白對照，每個檢測組設三組重復。
上機檢測：將配置好的體系放入熒光定量PCR儀中，激發和發射波長分別調至熒光染料相應波長，升溫速率通常設為1℃/10s，溫度變化范圍一般從25℃到75℃或100℃，每1~3℃測定一次熒光強度(實驗條件會根據實際情況優化)。
數據分析：通過數據處理軟件，繪制出熒光強度隨溫度的變化曲線，通過擬合波爾茲曼(Boltzmann transport equation，BTE)方程，計算出蛋白樣品的Tm值及相關參數。
三、DSF的優勢
DSF作為一種高效的蛋白質穩定性分析技術，具有以下顯著優勢：
無需標記：Nano DSF無需使用熒光染料，直接檢測蛋白紫外熒光，簡化了實驗步驟。
高通量篩選：DSF可以在短時間內對大量蛋白樣品進行穩定性分析，提高了篩選效率。
低樣品消耗量：每個樣品僅需10~25?L，低濃度僅需0.5?g/mL，降低了實驗成本。
數據精度高：DSF的數據精度高，Tm值的變異系數(CV)小于0.1%，確保了實驗結果的可靠性。
溫度變化范圍廣：DSF的溫度變化范圍廣泛，從25℃到100℃不等，適用于不同熱穩定性的蛋白質分析。
四、DSF在蛋白質穩定性分析中的應用
DSF在蛋白質穩定性分析領域具有廣泛的應用前景，主要包括以下幾個方面：
蛋白質穩定性評估：DSF可以高通量測定蛋白質的熱穩定參數，評估突變、pH、離子強度等因素對熱穩定性的影響，篩選出提高熱穩定性的因素。這對于理解蛋白質功能、預測蛋白質行為具有重要意義。
蛋白質結構研究：蛋白質結晶是研究蛋白質結構的重要手段，DSF可以高通量篩選蛋白質的結晶條件，為蛋白質結構研究提供有力支持。
蛋白質-配體相互作用研究：配體與蛋白質結合一般會導致蛋白質的熱穩定性改變，DSF可以通過測定蛋白質的熱穩定性參數，評估配體與蛋白質之間的相互作用，有助于揭示蛋白質在生物體內的功能機制。
藥物篩選與設計：DSF可用于評估藥物與蛋白質的結合能力以及藥物對蛋白質穩定性的影響，從而指導藥物篩選和設計。通過對化合物配體庫進行高通量篩選，獲得與蛋白樣品相結合的候選化合物，評估化合物對蛋白穩定性的影響，篩選出蛋白質穩定劑、抑制劑、輔助因子及分子伴侶。
疾病診斷與預防：DSF可用于檢測疾病相關蛋白質的穩定性變化，如癌癥、神經退行性疾病等，為疾病的早期診斷和預防提供有力工具。
五、總結
DSF作為一種高靈敏度的熱分析方法，在蛋白質穩定性分析領域展現出了巨大的潛力和應用前景。隨著技術的不斷進步和應用范圍的擴大，DSF將在生物科學研究、藥物研發以及疾病診斷和治療中發揮越來越重要的作用。通過優化熒光探針和實驗條件，進一步提高DSF技術的靈敏度和準確性，以更精確地評估蛋白質的穩定性，為揭示蛋白質功能機制、指導藥物研發以及疾病診斷和治療提供有力支持。
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